INNE EBOOKI AUTORA
-14%
Prezentowane w publikacji techniki są obecnie stosowane w większości laboratoriów zajmujących się biologią molekularną, ale ciągle brak ich opisu w literaturze polskojęzycznej. Wykłady do fakultetu „Molekularne techniki analizy RNA” obejmują aktualny stan wiedzy na temat metabolizmu RNA u eukariontów oraz teorię technik pozwalających na badanie poziomu RNA w komórce, nowo syntetyzowanego transkryptu oraz badania oddziaływań białek uczestniczących w transkrypcji.
Na ćwiczeniach praktycznych studenci poznają wybrane techniki badania RNA na przykładzie organizmów modelowych: drożdży Saccharomyces cerevisiae oraz rzodkiewnika Arabidopsis thaliana.
Prezentacja metod jest ilustrowana odpowiednimi przykładami, w których studenci samodzielnie badają poszczególne rodzaje RNA, jak utajnione, niestabilne transkrypty CUT czy microRNA, i etapy ich metabolizmu. Skrypt ten zawiera zarówno wprowadzenie teoretyczne odwołujące się do najnowszych pozycji literaturowych, jak i opis wykonania poszczególnych eksperymentów.
Skrypt adresowany do osób zainteresowanych metabolizmem RNA oraz nowoczesnymi, molekularnymi technikami jego badania – studentów wszystkich kierunków Wydziału Biologii i Międzywydziałowych Indywidualnych Studiów Matematyczno-Przyrodniczych Uniwersytetu Warszawskiego.
Rok wydania | 2013 |
---|---|
Liczba stron | 64 |
Kategoria | Biologia molekularna |
Wydawca | Uniwersytet Warszawski |
ISBN-13 | 978-83-235-1755-9 |
Numer wydania | 1 |
Język publikacji | polski |
Informacja o sprzedawcy | ePWN sp. z o.o. |
INNE EBOOKI AUTORA
POLECAMY
Ciekawe propozycje
Biochemiczne i molekularne podstawy...
do koszyka
Biologia molekularna bakterii
do koszyka
Ekologia molekularna
do koszyka
Genetyka medyczna i molekularna
do koszyka
Spis treści
Wstęp | 7 |
1. Analiza northern – detekcja RNA na filtrach. Wykrywanie prekursorów rRNA u drożdży | 9 |
Opis i cel doświadczenia | 9 |
ĆWICZENIE 1. Izolacja całkowitego RNA z różnych organizmów oraz ocena jakościowa uzyskanego preparatu | 10 |
Metody izolacji RNA | 10 |
RNazy | 10 |
Dobra praktyka laboratoryjna | 11 |
Inhibitory RNaz | 11 |
Przechowywanie RNA | 12 |
Ocena jakości RNA | 12 |
Izolacja całkowitego RNA z komórek drożdżowych | 13 |
Literatura | 14 |
ĆWICZENIE 2. Elektroforetyczny rozdział RNA w żelu agarozowym i ocena jakości RNA | 15 |
Technika northern | 15 |
Znakowanie izotopowe | 15 |
Znakowanie nieizotopowe | 15 |
Detekcja znaczników nieradioaktywnych | 16 |
Elektroforeza RNA z drożdży w żelu agarozowym w warunkach denaturujących | 16 |
Transfer kapilarny | 17 |
ĆWICZENIE 3. Wykrywanie prekursorów rRNA u drożdży – hybrydyzacja | 18 |
Skład buforów | 18 |
Procedura hybrydyzacji | 18 |
Odpłukanie nadmiaru sond | 18 |
Wizualizacja hybrydyzacji | 18 |
Literatura | 18 |
2. Analiza northern – wykrywanie transkryptów CUT u drożdży | 20 |
Wstęp | 20 |
Co to są CUTy? | 20 |
Funkcje CUTów | 21 |
Literatura | 21 |
ĆWICZENIE 4. Elektroforeza RNA w denaturującym żelu poliakrylamidowym | 23 |
Elektroforeza RNA w 6% żelu poliakrylamidowym z 7 M mocznikiem | 23 |
Transfer elektryczny mokry | 23 |
ĆWICZENIE 5. Hybrydyzacja RNA na membranie z sondą radioaktywną specyficzną wobec IGS1-R, wyznakowaną metodą „random-priming” | 24 |
3. Wykrywanie małych RNA | 25 |
Wstęp | 25 |
Małe interferujące RNA: miRNA i siRNA | 25 |
Wybrane metody detekcji małych RNA (iRNA) | 26 |
Literatura | 28 |
ĆWICZENIE 4. Pulsacyjny RT-PCR, cz. 1 – pulsacyjna odwrotna transkrypcja | 29 |
Materiały | 29 |
Trawienie DNazą | 29 |
Pulsacyjna odwrotna transkrypcja | 29 |
ĆWICZENIE 5. Reakcja PCR – cz. 2 | 31 |
ĆWICZENIE 6. Rozdział w żelu agarozowym produktów pulsacyjnego RT-PCR | 32 |
Przygotowanie próbek | 32 |
4. Badanie końców cząsteczek RNA na przykładzie drożdżowych prekursorów snoRNA. Technika cRT-PCR | 33 |
Wstęp | 33 |
RNaza H | 33 |
Ligacja RNA | 34 |
Literatura | 34 |
ĆWICZENIE 6. Trawienie RNazą H i ligacja RNA | 35 |
Trawienie RNazą H | 35 |
Ligacja RNA | 36 |
ĆWICZENIE 7. Reakcja odwrotnej transkrypcji i PCR | 37 |
Reakcja odwrotnej transkrypcji | 37 |
PCR | 37 |
ĆWICZENIE 8. Elektroforeza produktów PCR | 38 |
5. PCR ilościowy: RT-qPCR | 39 |
Wstęp | 39 |
Formaty detekcji produktów qPCR | 39 |
Kontrola jakości RNA | 40 |
Analiza doświadczeń qPCR | 40 |
Najbardziej kluczowe elementy RT-qPCR | 41 |
Literatura | 42 |
ĆWICZENIE 8. Projektowanie starterów do qPCR – konkurs na najlepszą parę starterów | 43 |
Wskazówki do projektowania starterów | 43 |
Wykonanie ćwiczenia | 44 |
ĆWICZENIE 9. Testowanie zaprojektowanych starterów do qPCR | 45 |
Przygotowanie starterów | 45 |
Przygotowanie reakcji qPCR | 45 |
ĆWICZENIE 10. Analiza reakcji qPCR | 46 |
6. Oznaczenia aktywności enzymów biorących udział w obróbce RNA | 47 |
Oznaczanie aktywności enzymów hydrolizy kapu | 47 |
Struktura kapu transkryptów polimerazy RNA II | 47 |
Hydroliza kapu | 48 |
Badanie enzymatycznej hydrolizy kapu | 49 |
Oznaczanie aktywności endonukleazy Rnt1 | 50 |
Endonukleazy z rodziny RNazy III | 50 |
Rnt1 | 51 |
Biogeneza sn/snoRNA u drożdży Saccharomyces cerevisiae, rola Rnt1 | 52 |
Literatura | 53 |
ĆWICZENIE 11. Analiza aktywności Rnt1 w ekstrakcie drożdżowym | 55 |
Protokół | 55 |
7. Analiza oddziaływania białka z kwasem nukleinowym: test opóźnienia migracji w żelu (EMSA) | 58 |
Wstęp | 58 |
Analiza EMSA | 58 |
Terminacja transkrypcji polimerazy RNA I | 59 |
Literatura | 60 |
ĆWICZENIE 12. Wiązanie Reb1 do IGS1 rDNA in vitro | 61 |
Badane warianty IGS1 rDNA S. cerevisiae | 61 |
Wiązanie białka do DNA | 61 |
Rozdział w natywnym żelu poliakrylamidowym | 61 |
8. Sztuczne microRNA – amiRNA | 63 |
Wstęp | 63 |
Wybrane zalety amiRNA | 64 |
Wady amiRNA | 64 |
Literatura | 64 |
ĆWICZENIE 13. Projektowanie amiRNA | 64 |